Con el comienzo de la guerra civil se paralizaron las actividades de las Misiones Pedagógicas. De julio a septiembre de 1936, los misioneros que se encontraban en Madrid y que no habían marchado al frente formaron catorce equipos de tres personas y realizaron algunas actuaciones. En octubre se nombró dentro del Patronato una Comisión de Propaganda Cultural. Su archivo gráfico y fílmico se empleó a partir de entonces en acciones culturales en defensa de la República. La utilización de las fotografías de las Misiones en los fotomontajes de Renau en el pabellón español de la Exposition Internationale des Arts et Techniques dans la Vie Moderne de París, en 1937, sirvió para sensibilizar a amplios sectores de la intelectualidad europea sobre el desastre que vivía España. Desde Valencia, la infraestructura creada por el sistema bibliotecario de las Misiones Pedagógicas continuaría funcionando casi hasta el fin de la contienda.
El destino que corrieron las más de 600 personas que en un momento dado formaron parte de las Misiones Pedagógicas fue muy variado. Algunos misioneros murieron asesinados nada más comenzar el conflicto; otros se enrolaron en las Milicias de la Cultura o en las Brigadas Volantes; otros fueron encarcelados, expedientados o marcharon al exilio. Y también hubo algunos que se integraron en las filas franquistas.